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光电化学材料与器件研究 缓释骨形态发生蛋白-2促进骨修复的生物相容性载体研究进展

江汉大学学报自然科学版2019-01-16 20:46:23

光电化学材料与器件研究 缓释骨形态发生蛋白-2 促进骨修复的生物相容性载体研究进展


作者郑志强1a,1b,雷杨1a,1b,尤庆亮1b,田玉1b,张正涛1a何荣祥1a,陈勇1a,2,张玮莹*1a,曹一平1a,1b(1. 江汉大学 a. 交叉学科研究院;b. 光电化学材料与器件教育部重点实验室,化学与环境工程学院,湖北 武汉 430056;2. 巴黎高等师范学院 化学系,巴黎 75231)


摘    要

骨形态发生蛋白-2(bone morphogenetic protein-2,BMP-2)属于转化因子,是一种多功能生长因子,在细胞增殖、分化迁移和重建方面具有重要作用。在临床骨缺损修复中,BMP-2是参与体内骨修复至关重要的促进因子。一方面,由于BMP-2在体内的稳定性不强;另一方面,如果无载体保护,其在移植处的释放扩散形式呈“爆炸式”。而骨生长分化是一个动态的过程,因此需要建立一个可控的缓释载体。介绍了目前已应用的4 种BMP-2 控制释放载体,包括水凝胶和微囊、层层自组装(layer-by-layer self-assembly,LbL)、表面微处理的钛金属以及静电纺丝纤维。

关键词

骨形态发生蛋白-2;控制释放;骨修复


0 引言

随着人们对组织工程和药物控制释放系统的深入研究,生物医学材料逐渐被人们重视。组织工程方法是通过体外培养扩增种子细胞,复合具有良好生物相容性、可降解性的生物材料(支架),形成细胞-材料复合物。将该复合物植入机体器官病损部位来实现修复组织创伤和重建功能[1]。细胞、支架和生长因子是组织工程的三大要素[2]。其中三维支架为细胞获取营养及生长代谢提供良好的环境,生长因子则可以调节细胞分化、增殖等。支架可以通过生物相容性材料构建,而在生理环境下,如需生长因子起到一定的调节作用,则需长期维持其生物活性,这就必须依赖于可控的缓释技术。

具备骨诱导增殖分化、药物缓释的复合生物材料是骨组织工程的一个研究热点。一些具备较强的骨诱导活性的生长因子,如重组人骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein,BMP)系列蛋白,已结合不同的生物材料,被美国FDA 批准用于临床上的骨缺损修复和替换等。BMP 分子量约为30 kDa,是一种不含胶原的糖蛋白,成熟的BMP分子是由一个依赖半胱氨酸二硫键固定的双链多肽二聚体分子,其结构中40%~50%与转化生长因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)高度同源。作为细胞生长分化的调控因子,BMP家族中BMP-7和BMP-2被研究得最多,是具备骨增殖分化重要的调节因子。本文重点综述了负载BMP-2以促进骨修复的生物相容性载体最新研究进展。

BMP-2 的应用效果很大程度上依靠缓释系统。可控的药物缓释体系是利用天然或合成的高分子材料作为药物载体,然后置于一定的生理环境下,控制其在机体内的缓释速率,使药物按照预设的剂量,在外界pH、光照及响应因子等的刺激下,在机体内缓慢释放进而达到修复的目的。因为BMP-2等生长因子在体内维持其生物活性的时间大约是数秒至数分钟[3],有的甚至不能在生理环境下稳定存在,进而不能有效提供给靶向位置急需的、持续有效的浓度。目前常用的材料,如牛血清蛋白(BSA)、聚乳酸-羟基乙酸共聚物(poly(lactic-co-glycolic acid),PLGA)等这一类高分子材料都被应用于BMP 的运载与释放。

本文介绍了目前已应用的4 种BMP-2 控制缓释体系,分别是共混入生物相容性材料、层层自组装(layer-by-layer self-assembly,LbL)、载入表面处理后的钛金属表面以及直接嵌入纺丝材料或载入微球后嵌入纺丝材料。与此同时,介绍了各种载体的分子设计、制备方法和应用效果。

1 目前主要的缓释体系

BMP-2控制缓释支架的构建通常是将生长因子和种子细胞负载入生物相容性材料,通过探究因子的释放速率及诱骨分化效果来评价载体的载入及释放效果。目前常用的载入方法有物理共混、对载体进行化学修饰及因子封装等。

1.1 共混入生物相容性材料

共混入生物相容性材料的主要方法是利用生物可降解的材料构建一个仿生化的三维结构,并将干细胞或者生长因子复合在材料中,并最终应用于修复或替换缺损组织或器官。这类生物材料需具备一定的力学性能,提供细胞的“着床”环境并随着细胞增殖而逐渐降解[4]

所用支架材料通常包括两类:合成高分子材料和天然材料。合成高分子材料有着良好的可控性,如聚己内酯(PCL)、聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)等聚合物材料,可根据需要调节其力学性能、降解性能等。天然材料主要指天然的或从人或动物体内提取的材料,这一类材料包括胶原、明胶、纤维素、壳聚糖、海藻酸盐等。

1.1.1 合成高分子材料 SUBRAMANIAN 等[5]研究了一种以PCL 为载体的可注射性成骨支架材料,复合了胶原蛋白、BMP-2 和小鼠成骨细胞(MC3T3-E1)。通过改变PCL 纳米纤维的含量能够控制其机械强度以及BMP-2 的生物活性。在体外孵育培养MC3T3-E1 细胞过程中,通过空白对照,结果表明该可注射支架不仅提供了骨原细胞分化的环境,还充当了良好的控制成骨因子释放的生物活性载体(见图1[5])。

1.1.2 天然材料 水凝胶是具有溶胀性和三维交联网络结构的高分子聚合物,并且含有大量的水分,可以用来携载药物以达到缓释的目的[6],这些性能使水凝胶在生物医药领域具有巨大的应用潜能。YAMAMOTO 等[3]研究了一种以水凝胶为载体的促骨生长载体,这种载体以戊二醛交联的明胶水凝胶为载体,载入碘标记的125I-labeled BMP-2。将这种水凝胶载体植入到骨受损的小鼠背部,结果表明皮下移植含有水凝胶的BMP-2 的碱性磷酸酶(ALP)活性比直接注射含BMP-2 的溶液高,且BMP-2 的生物活性从5 d 延长到25 d 左右。水凝胶本身的三维网络结构和细胞外基质十分类似,且外界环境中的氧气、营养物质、生长因子等均可以通过网络结构传递到水凝胶内部的细胞,利于细胞的黏附、增殖和分化[7]。SUKARTO 等[8]将生长因子BMP-6 和TGF-β3 以及脂肪干细胞共混入光引发诱导凝胶化的甲基丙烯酸酯接枝的聚乙二醇-壳聚糖材料(MGC),共微囊化后,并接枝精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)肽序列制备MGC 水凝胶(见图2[8])。结果表明,与空白组相比,该凝胶系统中诱导因子BMP-6和TGF-β3的释放时间持续28 d左右,并且成功地提高了脂肪干细胞向软骨分化的效率。其分化的软骨细胞特征性的粘多糖和Ⅱ型胶原表达水平明显高于空白组,这种水凝胶载体有望应用于软骨修复。

GAO 等[9]将地塞米松和rhBMP-2 负载到羟基磷灰石纳米粒子上,以壳聚糖/β-甘油磷酸酯注射水凝胶为载体。实验表征,通过扫描电镜观察到所负载因子的纳米粒子可以均匀地分布在水凝胶中,而且在体外模拟诱导成骨分化中,发现所制备的载体能够更好地诱导间叶细胞的增殖和成骨分化。SHEN等[10]首先将BMP-2和基质细胞衍生因子(SDF-1)负载在丝纤蛋白微球(SF)/羟基磷灰石复合支架上,实验表明,表层物理吸附的SDF-1释放迅速,而封装于SF微球中的BMP-2释放时间达3周。该复合型载体基于双重因子的协同作用,能够较好地促进骨再生。为了克服骨修复材料易感染的缺点,NIU等[11]基于CS接枝的PLA共聚物在三聚磷酸盐作用下自组装成纳米微球的原理,负载了疏水性氟轻松(FA)和亲水性BMP-2。结果表明,负载双重因子的实验组所表达的ALP 活性高于空白组和单一因子组,这种载体在同时负载亲疏水的生物因子及药物控制释放方面具有一定的应用价值。

通过共混入生物相容性材料所制备的可控缓释载体,以水凝胶为例,作为一种高吸水高保水材料,提供了细胞黏附和增殖的“着床”环境。其中,可注射的生物相容性水凝胶,通过封装生长因子(BMP-2,BMP-6 等骨形态生成蛋白)和种子细胞(骨髓间充质干细胞、诱导多功能干细胞等)植入骨受损部位达到骨修复的目的。这种水凝胶能较好地填充骨缺损处,不受其几何结构和形状的限制。然而水凝胶载体材料也存在感染的风险,可通过加入抗感染的因子(如Ag 纳米粒子、抑菌因子等)来克服。

1.2 层层自组装

层层自组装(layer-by-layer self-assembly,LbL)是一种重要的薄膜制备技术,它具有组装分子广泛、操作简单、条件温和等优点。在膜分离、催化、生物传感器以及药物的控制释放等领域有着重要的应用价值[12]。由于这种组装方法所制备的薄膜形貌可控,可与多种载体复合,可以嵌入各种生长因子或者药物。因此,利用LbL 技术制备多层膜在药物控制释放领域中的应用越来越受到人们的关注,具有潜在的研究价值。

1.2.1 生长因子作为聚电解质 SHAH等[13]以表面有纳米孔径(< 300 nm)的PLGA薄膜为载体,利用生长因子BMP-2/血小板衍生因子(platelet-derived growth factor-BB,PDGF-BB)与聚丙烯酸(PAA)、聚β-氨基脂(Poly-2)的静电作用,正负交替层层自组装成生物缓释模型(见图3[13])。从结构上看,有空洞的形态结构一方面建立了支架与宿主环境的交流,另一方面允许营养流通及细胞的迁移和血管化。若空洞过大,则不利于细胞的黏附或者引起软组织的脱落下垂。在PEM多层膜的构建中,底部为BMP-2,顶部为PDGF-BB,ELISA试剂盒检测到PDGF-BB的释放时间持续约11 d,BMP-2的释放时间持续约20 d,并且释放过程中没有出现“爆释”现象。临床动物实验表征中,通过显微CT(μCT)和组织学评价实验观

察,双重生长因子释放的测试组中的骨修复效果明显优于单一因子释放组及空白组(见图4[13])。


1.2.2 生长因子不作为聚电解质 CAI等[14]通过LbL技术构建了烯丙胺盐酸盐(PAH)和聚苯乙烯磺酸钠(PSS)多层膜。这种缓释模型类似于“水库”,能够将BMP-2 暂时储存,克服了BMP-2 作为LbL 成分而失活的缺点。实验表明,在这种聚电解质多层膜上,骨髓间充质干细胞(MSC)所表达的ALP 活性明显优于单纯添加BMP-2的培养基空白组。同时,这种模型更好地促进了MSC的早期分化,有望应用于医学植入材料和组织工程材料(见图5[12])。类似的水库模型,如CROUZIER 等[15]层层自组装了聚(L-赖氨酸)/透明质酸(HA)多层膜,也具有储存缓释rhBMP-2的特点。实验表征,rhBMP-2的储存量取决于沉积的初始量及多层膜的厚度,且俘获rhBMP-2的活性不因PEM多层膜的降解而受到影响。此外,该多层膜的生物活性在3次循环孵育及释放生长因子的过程中不易失活,有望应用于定点缓释生长因子和干细胞分化等方面。

LbL技术基于条件温和的制备环境,最大程度上保留了生物分子(蛋白质、多糖、DNA等)的生物活性。以柔性的基底如PLGA、聚乳酸(PLA)为载体,更是满足了临床实验中填充不同骨缺损面的要求。另外,CAI 等[14]和CROUZIER 等[15]创造性地利用聚电解质多层膜的“水库”模型储存生长因子,而非将其作为组装的成分,避免了因子的失活。这类LbL多层膜的载体将在干细胞分化和骨再生的研究中具有广阔的应用前景。

1.3 载入表面处理后的钛金属表面

钛及其合金因生物相容性较好、弹性模量与自然骨相近等特点在骨修复等医疗领域获得广泛应用。但是由于其本身的生物惰性制约了钛及其合金骨修复材料的应用和发展,如何实现种植体与周围骨组织之间的快速结合是骨修复方面面临的关键性问题。对其进行生物化处理,并将治疗因子引入到纯钛表面,既可以提高种植体材料表面的生物活性,又可促进材料与骨组织之间的骨性结合。江巧红[16]将纯钛表面打磨抛光及喷砂酸蚀,形成多孔状结构,然后通过层层自组装方法,将钛片浸入聚阳离子电解质壳聚糖(CS)溶液中,接着浸入聚阴离子电解质透明质酸钠(HA)和带绿色荧光蛋白的pEGFP-C1-BMP-2 质粒复合物溶液组装到多孔钛片表面。实验表明,对pEGFP-C1-BMP-2 质粒DNA荧光标记结果显示钛片表面质粒的量随着组装层数的增加而增加。另外,在体外诱导小鼠颅骨来源的成骨前体细胞系(MC3T3-E1)分化实验中,相比空白对照组,含BMP-2 质粒复合物的钛片表面明显促进了MC3T3-E1细胞的增殖及骨向分化,其中碱性磷酸酶和骨钙素的蛋白表达水平得到上调。BAE[17]通过对钛表面进行阳极氧化处理,得到亲水性良好的纳米管氧化态TiO2 表面(直径约100 nm,长度约500 nm)。然后进行rhBMP-2的孵育,实验结果表明,相比未氧化的钛表面,BMP-2的释放方式呈“稳定”速率。而且,从ALP的表达量和钙矿物沉积量表明,氧化组明显优于空白组(见图6[17])。SHEN[18]在表面经氨基化的Ti6Al7Nb合金表面层层自组装明胶(Gel)/CS薄膜,然后将透明质酸-阿仑膦酸钠/BMP-2 纳米粒子负载在聚电解质薄膜上。结果表明,随着多层膜的降解,该种植体能实现BMP-2的缓慢释放,且能提高骨的增殖分化效率。

在骨缺损和再生修复研究中,对种植体表面进行生物活性涂层的探索从未停止。理想的生物涂层必须满足以下要求:1)能促进成骨细胞的黏附和骨分化;2)能以稳定的速率缓释成骨所需的生长因子。对钛表面进行一定的酸碱处理,再进行后期BMP-2、PDGF-BB 等生长因子的载入和修饰,能够改善其表面生物性能,更有利于骨组织的形成和分化。

1.4 直接载入纺丝材料或载入微球后嵌入纺丝材料

静电纺丝技术所制备的纺丝纤维膜能够提供高比表面积、高孔隙率等特点,同时可以根据所需纤维形貌、直径及力学性能、降解性能等通过调节纺丝溶液及纺丝参数来实现所需要求。基于上述诸多优点,静电纺丝技术已广泛应用于生物医学中,如组织工程、创伤修复、药物传递、小尺寸血管支架等各个方面[19]。然而,通过此技术所制备的支架的力学性能通常达不到无机材料或者无机材料与天然、有机材料复合支架的力学性能,因此其制备的支架主要用于非承重骨缺损的修复。

1.4.1 直接载入纺丝材料 KOLAMBKAR 等[20]利用静电纺丝纤维管状支架复合多肽改性并携载BMP-2的海藻酸水凝胶来诱导骨再生修复,显微CT发现缺损部位的骨性桥接。相比空白组,即使有纳米纤维支架及海藻酸凝胶也没有看到持续性的骨形成。FERRAND 等[21]将负载BMP-2 的壳聚糖纳米“水库”复合到PCL静电纺丝纤维中用于大鼠颅骨缺损修复。通过静电纺丝制备的三维纳米纤维支架结构可以模拟骨基质的纤维状结构,同时通过层层自组装法沉积聚赖氨酸(PLL)/ BMP-2 或壳聚糖BMP-2于纤维支架表面,通过2D拉曼峰映射谱图发现在BMP-2存在的情况下,体内外均可看到矿物沉积,而在CS/BMP-2 上面更为显著。SROUJI 等[22]制备了核层载BMP-2 的PCL/聚乙二醇(PEG)核壳型静电纺丝纤维。BMP-2携载量释放曲线(见图7[22])显示BMP-2的释放速率与孔的直径及密度正相关,BMP-2的释放时间可以达到约600 h,绝大多数时间点的BMP-2 浓度很低,表明该体系能够实现可控缓释。从大鼠颅骨缺损修复的情况看,BMP-2释放速率适中、表面孔隙度适中的S2组对于颅骨骨修复的效果最好。以上结论表明BMP-2长期有效的持续释放才能更好地促进颅骨修复。

1.4.2 载入微球后嵌入纺丝材料 设计能够可控、持续、缓释周期较长的生物活性释放方式对于骨修复是至关重要的[23-26]。如延长缓释的周期不能满足正常骨修复及重建所需的时间,则需要设计多层屏障结构载体。LIU等[27]设计的纳米颗粒包载结构实现了生长因子的多层屏蔽作用,他们的制备方法如图8 所示,纳米颗粒作为载体可以保护药物(成纤维细胞生长因子,bFGF)活性,同时也作为药物释放的第一层屏障,纳米纤维作为药物的第二层屏障,从而明显延长了生物活性因子的释放周期,长达约30 d。从释放曲线可知,多屏障结构比核壳型静电纺丝纤维的释放效果好。李龙[28]通过去溶剂法制备了牛血清蛋白(BSA)纳米颗粒(NPs)及载入BMP-2的BSA纳米颗粒(BNPs),然后利用静电自组装在所制备的纳米颗粒上自组装上壳聚糖外壳以起到稳定作用。将BNPs与地塞米松(DEX)一起包载于聚己内酯-聚乙二醇(PCE)静电纺丝纤维中,从而制备了可控释放的载双药组织工程支架。体外诱导成骨检测发现,载双药纳米纤维组BNPs/DEX/PCE 具有良好的诱导成骨能力。如图9 所示,WANG 等[29]PLGA/PEG 及PLGA 静电纺丝上同时负载了重组人源血管内皮生长因子(rhVEGF)、BMP-2 和磷酸钙(Ca-P)3 种生物因子,实验表明,人脐静脉内皮细胞(HUVECs)和小鼠胚胎来源的间充质干细胞(C3H10T1/2)均在纺丝薄膜上有较好的生物活性和细胞存活率,且能够促进C3H10T1/2的成骨分化。

静电纺丝技术为骨修复组织工程3D 支架材料的构建提供了新的思路。改变一定的纺丝条件,可构建实心、管状及核壳机构的纤维。纤维间的孔隙为细胞摄取营养成分及分泌相关蛋白具有重要作用。另外,负载一系列诱导分化、成骨的生长因子(如BMP-2等)及种子细胞(脂肪干细胞、骨髓间充质干细胞等),更能缩短骨修复的周期,静电纺丝有望成为骨组织工程支架材料的选择。

2 结论与展望

BMP-2对于促骨分化有重要的作用。鉴于其在体内保持活性的时间较短,需要借助一种理想的生物相容性载体。本综述系统地介绍了4 种缓释BMP-2 的生物相容性缓释载体。这些载体不仅保留了BMP-2的生物活性,而且延长了其在体内的半衰期,在特定的骨损伤处实现了可持续性的缓慢释放并有效地促进了骨修复。借助于水凝胶、静电纺丝、改性的钛金属等生物相容性材料,可以实现良好的骨修复,这为骨再生医疗方向打开了新的道路。

构建一个理想的骨组织工程支架关键要素有以下几点:1)具备可控的孔隙率,其中孔径在20~100 μm 为佳,以实现与体内正常骨组织相互连通;2)足够的机械强度和可控的降解性能;3)种子细胞接种过程中能够提供无菌环境。此外,控制支架的降解速率及促骨生长效果,来匹配替代骨组织的再生率是其进一步研究和改进的目标。相比上述的3 种材料,静电纺丝由于其操作简单,具有可控的孔隙率及机械强度,在骨修复方面具有良好的发展前景。

基金项目:国家自然科学基金青年基金资助项目(31600801)


文献来源:郑志强,雷杨,尤庆亮,等. 缓释骨形态发生蛋白-2促进骨修复的生物相容性载体研究进展[J]. 江汉大学学报(自然科学版), 2017, 45(4): 307-316.


DOI:10.16389/j.cnki.cn42-1737/n.2017.04.003